5.3.2 Inibição não-competitiva – Formação de complexo estável

        Um grande número de drogas, incluindo metilenedioxibenzenos, alquilaminas, antibióticos macrolídeos e hidrazinas, sofre ativação metabólica pelo CYP para formar metabólitos inibitórios. Estes metabólitos podem formar complexos estáveis com o heme do CYP (figura 11), chamado complexo metabólico intermediário (CMI), de forma que o CYP fique em um estado inativo funcionalmente (estas substâncias são chamadas de substratos suicidas); a formação deste complexo pode ser revertida e a função catalítica do CYP férrico pode ser restaurada por incubação in vitro com compostos altamente lipofílicos que deslocam o metabólito intermediário do sítio ativo da enzima. A dissociação ou deslocamento do CMI resulta na reativação da atividade funcional do CYP; porém, em situações in vivo, o CMI é tão estável que o CYP envolvido neste complexo fica indisponível para a biotransformação de drogas e a síntese de novas enzimas é a principal maneira pela qual a atividade pode ser restaurada.

FIGURA 11 - Estruturas propostas para o CMI formado durante o ciclo catalítico do CYP.
Esquerda – compostos com o grupo metilenedioxifenil formando um complexo carbene-ferro; Centro – Alquilaminas formando um complexo nitroso-ferro. Direita – 1,1 dialquil-hidrazinas formando um complexo nitrene-ferro. Fonte - LI & LU, 1998.

        O piperonil butóxido, um derivado metilenedioxibenzeno, tem sido usado como um inibidor do metabolismo oxidativo de drogas. Este composto age por formar um CMI, provavelmente por uma ligação entre o carbono e o ferro (figura 11).

         A troleandomicina e a eritromicina são os antibióticos macrolídeos mais estudados na inibição seletiva que envolve a formação de CMI. Estes 2 agentes possuem em sua estrutura uma amina terciária (figura 12) que depois de passar por várias etapas de biotransformação mediadas pelo CYP (N-demetilação, N-hidroxilação e N-oxidação) produz um metabólito nitroso que se liga fortemente ao CYP ferroso (figura11) levando a formação de um CMI.

FIGURA 12 - Estrutura dos antibióticos macrolídeos troleandomicina e eritromicina. Em destaque o grupo amino terciário.

        Os derivados de metilenedioxibenzeno e os macrolídeos, como a troleandomicina e eritromicina, não agem somente como inibidores mas também produzem efeitos de indutores. Doses repetidas de troleandomicina induz o CYP em ratos (PESSAYRE et al, 1982a), entretanto a maioria das isoenzimas induzidas fica geralmente complexada e funcionalmente inativa. A concentração da CYP livre depende da dosagem diária de troleandomicina e da duração do tratamento.

         A CYP3A4 humana está entre as isoenzimas induzidas pela troleandomicina. Em 6 pacientes tratados com troleandomicina (2g/dia durante 7 dias), verificou-se (PESSAYRE et al, 1982b) um aumento de 76% do CYP total comparado com o grupo controle; porém a maioria do CYP induzido estava presente na forma de CMI; a eritromicina produz efeito semelhante (DANAN et al, 1981).

         Os efeitos indutores da troleandomicina e da eritromicina são causados pela diminuição da degradação do CMI, e não pelo aumento da síntese do CYP. Uma vez que a maioria do CYP induzido está na forma de complexo e portanto não disponível para biotransformação in vivo, a indução pela formação de CMI pode ser mascarada pelos efeitos inibitórios destes antibióticos.

         Outra droga alquilamina, associada com a formação de complexo com o CYP, é a orfenadrina (figura 13) - um relaxante muscular usado no tratamento da doença de Parkinson. Como esta droga possui um grupamento amino terciário, se acredita que o metabolismo da alquilamina para um metabólito nitroso é a reação de biotransformação que dá origem ao CMI (REIDY et al, 1989).

FIGURA 13 - Estrutura da orfenadrina

        Os derivados da hidrazina pertencem a uma outra classe de compostos que podem levar a formação de CMI. O tipo de substituição da hidrazina é um fator importante para a formação do complexo envolvendo o CYP. A hidrazina 1,1-disubstituída, em contraste com a hidrazina monosubstituída, é oxidada pelo CYP para intermediários nitrene que se ligam fortemente ao ferro do grupo prostético heme, formando o complexo nitrene-ferro (figura 11). A isoniazida - a hidrazida do ácido isonicotínico (figura 14) - também leva a formação de CMI, o que pode explicar o porque da isoniazida, que é biotransformada principalmente pela N-acetilação em humanos, inibe a biotransformação da fenitoína e varfarina mediada pelo CYP (MUAKKASSAH et al, 1981).

FIGURA 14 - Estrutura da isoniazida.

5.3.3 Inibição irreversível do CYP – Inativação da enzima

        Algumas drogas contêm certos grupos funcionais que podem ser oxidados pelo CYP a intermediário reativos que causam a inativação irreversível da enzima antes da sua liberação do sítio ativo; ou seja, é necessária uma ativação metabólica para uma posterior inativação da enzima. Este tipo de inativação do CYP pode ser o resultado de alterações irreversíveis do grupo prostético heme ou da porção protéica, ou ainda uma combinação de ambos. De modo geral, as modificações do grupo heme sempre inativam o CYP, enquanto que alterações na proteína só resultam em perda da atividade catalítica se aminoácidos fundamentais para a ligação do substrato, transferência de elétrons ou ativação do oxigênio, forem modificados.

5.3.4 Alquilação do grupo heme

        Drogas que possuem uma ligação dupla (olefinas) ou uma ligação tripla (acetilenos) na porção terminal podem ser oxidadas pelo CYP para radicais intermediários que alquilam o grupo prostético heme e assim inativam a enzima. Entre as evidências da alquilação do heme inclui a demonstração de perdas equimolares de enzima e de heme, assim como o isolamento e a caracterização estrutural do heme adulterado. A alquilação do grupo heme é iniciada pela adição do oxigênio ativado para o carbono interno da dupla ou tripla ligação e é concluída com a ligação do carbono ao nitrogênio pirrólico do heme. É interessante observar que o acetileno reage com o nitrogênio do anel pirrólico A do CYP2B1 em microssomos hepáticos de rato induzidos por fenobarbital, enquanto que olefinas lineares reagem com o nitrogênio do anel pirrólico D (LI & LU, 1998).

         O etinilestradiol, um estrógeno amplamente utilizado como contraceptivo oral, é um derivado acetilênico (ver figura 15), que ao contrário de outros derivados de estradiol, tem atividade biológica longa e uma alta biodisponibilidade. Estudos realizados por GUENGERICH (1988), indicam que esta droga é um substrato para a CYP3A4 e também leva a destruição estrutural desta mesma enzima. Atualmente está esclarecido que a atividade longa e a alta biodisponibilidade do etinilestradiol são atribuídas principalmente a alteração do heme prostético da enzima que o biotransforma.

FIGURA 15 - Estrutura do etinilestradiol

        Assim como as olefinas e acetilenos, as diidropiridinas também podem ser oxidadas pelo CYP para metabólitos reativos que alquilam o heme prostético. Por exemplo, os radicais 4-alquil-1,4-diidropiridina são oxidados pelas enzimas do CYP para radicais intermediários que alquilam o nitrogênio do grupo heme. Porém nem todas as diidropiridinas provocam a alquilação do heme, a substituição na posição 4 do anel diidropiridina é um fator importante. A alquilação do heme é detectada se o substituinte é um grupo alquil alifático primário (metil, etil, propil); caso o substituinte seja um grupo aromático (fenil) ou um radical secundário (isopropil) não ocorre a alquilação do heme. Por exemplo, a nifedipina, uma diidropiridina com um aril na posição 4 (ver figura 16) não inativa o CYP (DE MATTEIS et al, 1982).

FIGURA 16 - Estrutura da nifedipina – uma diidropiridina com um substituinte aromático na posição 4.

5.3.5 Ligação covalente a apoproteína

         O exemplo mais conhecido de inativação do CYP através de modificação na cadeia de aminoácidos por um metabólito ativado é o caso do cloranfenicol. O grupo dicloacetamida (ver figura 17) é oxidado para um radical oxamil que acila um resíduo de lisina no sítio ativo do CYP (HALPERT, 1981), porém esta inativação pelo cloranfenicol não ocorre igualmente para todas as isoformas do CYP; estudos (HALPERT et al, 1985) com microssomos hepáticos de ratos revelaram que a CYP2B1, CYP2C6 e CYP2C11 são suscetíveis à inativação pelo cloranfenicol, enquanto a CYP1A1 e a CYP1A2 são resistentes.

FIGURA 17 - Estrutura do cloranfenicol com o grupo dicloacetamida em destaque.

        Outros compostos com uma ligação tripla terminal inativam o CYP por se ligarem covalentemente à proteína. Por exemplo o 2-etinilnaftaleno (figura 18) é convertido pela CYP2B1 para uma ceteno, que modifica o sítio ativo da enzima, incluindo a alteração em um resíduo de treonina da posição 302 que desempenha uma função importante na ativação do oxigênio molecular (ROBERTS et al, 1993).

FIGURA 18 - Estrutura do 2-etinilnaftaleno

        A oxidação de grupos contendo o enxofre também pode resultar em modificações da cadeia protéica do CYP. Vários compostos com enxofre podem inativar o CYP por ligação covalente a cadeia protéica depois que são ativados por oxidação pela enzima, como por exemplo o ácido tienílico - um tiofeno substituído - que é oxidado pela CYP2C9 para um metabólito reativo, possivelmente um sulfóxido tiofeno que se liga covalentemente a apoproteína do CYP (LOPEZ-GARCIA et al, 1993).

         De modo semelhante, os grupos contendo o nitrogênio também podem inativar o CYP. Por exemplo, as ciclopropilaminas são biotransformadas para metabólitos reativos e experimentos de BONDON et al, (1989) mostram que ocorre uma ligação covalente entre o radical ciclopropilamina e a proteína.

         Os dados a respeito do cloranfenicol, ácido tienílico e ciclopropilaminas mostram claramente que o CYP pode gerar espécies reativas que modificam a proteína, porém algumas drogas podem modificar a apoproteína e o grupo prostético heme simultaneamente. Por exemplo, a espironolactona (figura 19), um agente tioesteróide usado como diurético, pode inativar as subfamílias CYP2C e CYP3A e esta inativação ocorre depois da hidrólise do 7alfa-tioéster que dá origem a um grupo tiol livre - o CYP oxida então este radical tiol para um composto tioesteróide eletrófilico que se liga covalentemente a proteína e modifica também o grupo prostético heme (DECKER et al, 1989).

FIGURA 19 - Estrutura da espironolactona.

5.4 Mecanismos de Indução do CYP

        Um dos aspectos intrigantes do CYP é que algumas de suas isoformas (CYP1A1, CYP2C9, CYP2E1 e CYP3A4) são induzíveis e outras, não. Diferentemente da inibição, que é uma resposta quase imediata, a indução do CYP é um processo regulatório mais lento que pode reduzir a concentração de algumas drogas no plasma, e assim comprometer a eficácia terapêutica destas drogas.

         Apesar do fenômeno de indução do CYP ser conhecido há mais de 4 décadas, somente nos últimos anos os mecanismos envolvidos na indução começaram a ser elucidados. De um ponto de vista biológico, a indução é uma resposta adaptativa que protege as células de xenobióticos tóxicos, uma vez que aumenta a atividade de desintoxicação. A indução da biotransformação tem sido constatada depois da administração de doses terapêuticas de algumas drogas; porém o número de drogas que podem produzir este efeito é, talvez, mais limitado do que se suspeitava anteriormente.

         A rifampicina, os barbitúricos, a fenitoína e a carbamazepina estão bem estabelecidos como indutores que produzem mudanças clinicamente importantes na biotransformação de drogas. Recentemente mais algumas drogas, como o omeprazol e a sinvastatina têm sido observadas por causar mudanças na farmacocinética de alguns substratos para isoformas específicas do CYP, mas a importância clínica destas observações precisa ser melhor estabelecida. O uso de etanol e o tabagismo também podem causar a indução do CYP2E1 e CYP1A, respectivamente, o que pode ter implicações terapêuticas e toxicológicas importantes (GONZALEZ, 1988).

         Os indutores podem ser monofuncionais, quando promovem a indução apenas do CYP ou alguma isoforma específica, ou multifuncionais quando leva a indução de várias enzimas, incluindo as enzimas da fase I e da Fase II da biotransformação (figura 20) (PARK et al, 1996).

FIGURA 20 - Classificação dos indutores das enzimas biotransformadoras.
Adaptado de PARK et al, 1996.

        Os níveis de CYP hepáticos podem ser controlados pela concentração de seus substratos no fígado. Há muitos passos no caminho do DNA até chegar à enzima, e todos eles, em princípio, podem ser regulados. Dessa forma, uma célula pode controlar as enzimas, que ela faz das seguintes maneiras (figura 21):

a) quando e com que freqüência um determinado gene é transcrito (controle transcricional);
b) como o transcrito primário de RNA é processado (controle de processamento de RNA);
c) selecionando quais RNA mensageiros (mRNAs) maduros no núcleo da célula são exportados ao citoplasma (controle de transporte de RNA);
d) selecionando quais mRNAs no citoplasma são traduzidos pelos ribossomos (controle de tradução);
e) desestabilizando seletivamente certas moléculas de mRNA no citoplasma (controle de degradação de mRNA);
f) ativando, inativando ou compartimentalizando seletivamente moléculas de proteínas específicas depois que elas foram sintetizadas (controle de atividade de proteína) (ALBERTS et al, 1997).

FIGURA 21 - Mecanismos pelos quais as enzimas podem ser reguladas.
Fonte: ALBERTS et al, 1997.

        Algumas enzimas CYP estão presentes somente em baixos níveis e são induzidas por xenobióticos, enquanto outras são expressas continuamente em níveis relativamente mais altos.

         Para a maioria dos genes o controle transcricional é o predominante e portanto a maioria dos casos de indução do CYP é conseqüência de um aumento da transcrição genética, porém a regulação pós-transcricional tem sido reconhecida para CYP2E1 e possivelmente para CYP3A1. Por exemplo os níveis da CYP2E1 podem ser controlados pela fosforilação da enzima. Os agentes que levam a fosforilação desta enzima conseqüentemente aumentam a degradação da mesma, enquanto substratos que inibem esta fosforilação previnem a sua degradação a levam a um aumento dos níveis de CYP2E1. A fosforilação ocorre em um resíduo de serina na posição 129 e inicia uma rápida perda do grupo prostético heme (ELIASSON et al, 1990).

         Por muitos anos, os cientistas estão tentando resolver o mistério de como as células reconhecem o agente indutor e como o sinal é transferido para a maquinaria de transcrição. O mecanismo molecular de indução tem sido mais claramente definido para agentes químicos ambientais do que para os agentes terapêuticos, embora os princípios básicos sejam os mesmos.

         Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, representado principalmente pelo 2,3,7,8-tetraclorodibenzodioxina (TCDD), também chamado apenas de dioxina; são indutores efetivos de CYP1A1 e CYP1A2 que estão sob controles regulatórios similares. (THOMAS et al, 1983). A indução da CYP1A1 envolve a interação do indutor com um receptor citosólico hidrofóbico denominado de receptor Ah (hidrocarboneto aromático) e a translocação do complexo indutor-receptorAh para o núcleo da célula (POLAND et al,1976).

         O gene CYP1A1 possui uma região de controle gênico – que consiste de seqüências de DNA necessárias ao início de transcrição do gene e seqüências que regulam a taxa em que esta transcrição ocorre – chamada de elementos regulatórios receptor Ah (AhRE). O receptor Ah na sua forma ativa consiste de um heterodímero composto por um domínio ligado ao indutor (ALBD) e um transportador nuclear para o receptor Ah (ARNT). Na ausência de um indutor, o ALBD fica associado a uma proteína denominada HSP-90 (do inglês “heat shock protein”). O agente indutor penetra no citoplasma celular, desloca a HSP-90 de seu sítio de ligação e se liga ao ALBD. Isto permite o transportador nuclear (ARNT) se associar com o ALBD para formar o complexo indutor-receptorAh. A translocação deste complexo para o núcleo permite que ele se ligue ao AhRE do gene CYP1A1 levando ao aumento da taxa de transcrição do gene conforme esquematizado na figura 22 (WHITLOCK, 1993).

FIGURA 22 - Mecanismo proposto para a indução do CYP1A1.
Adaptado de PARK et al, 1996.

        Receptores para a indução de outras isoformas do CYP, incluindo as famílias CYP2 e CYP3, que são responsáveis pela biotransformação da maioria das drogas, ainda não foram definidos.

         Vários genes da família CYP2 são induzidos pelos barbitúricos. Um estudo de PIKE et al (1985) demonstra que indução do CYP pelo fenobarbital em ratos é mediada pelo aumento do respectivo RNA mensageiro devido ao aumento da taxa de transcrição do gene e não envolve mudanças nas taxas de processamento, transporte ou degradação do RNAm. Embora existam vários estudos e possíveis mecanismos de regulação propostos para indução do CYP pelos barbitúricos, ainda não foi identificado um receptor envolvido neste caso. Um trabalho de SHAW & FULCO (1993) com o Bacillus megaterium sugere que os barbitúricos induzem o CYP por deslocar uma proteína regulatória repressora do seu sítio de ligação no gene.